脂肪酸去饱和酶代表一类氧依赖性酶，正在脂肪酸差异处所引入双键，将饱和脂肪酸降饱和为不饱和脂肪酸，催化脱饱和反映，从而出现单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸。行动脂肪酸合成途径中的环节酶加入脂肪酸的合成，对微生物脂肪酸双键处所、布局、数目出现特异性影响，不光能够添加脂肪酸的不饱和度，再有利于鞭策脂质积攒，对保护生物膜寻常布局和性能拥有主要意旨。咨议证实，不管是单表达如故共表达去饱和酶基因，都可正在必定水准上提升微生物的油脂含量、改进其饱和、不饱和脂肪酸的构成比例。

　　枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）HB1310是1 株已报道的高产油核桃内生菌，饱和酶是该菌株脂肪酸合成途径中的环节酶之一，安徽工程大学的叶景、徐思远、张琴*等人将克隆其去饱和酶基因de1、de2，竣工这两种基因正在i BL21（DE3）中的单表达与共表达，探究去饱和酶基因过表达对E.coli油脂产量及其脂肪酸组分的影响，获取高效的产油工程菌，以期为高产油工程菌的开拓和使用供应技艺维持。

　　采用1.0%琼脂糖凝胶电泳对 de1、 de2、 de基因的PCR扩增产品举行检测，结果如图1所示。从电泳图可看出，3 个基因的PCR扩增产品碱基长度约1 036、822、1 856 bp，与预期目的条带巨细相符，证实这些基因片断扩增凯旋。

　　重组表达质粒pET-28a-de1、pET-28a-de2、pET-28a-de抽提纯化，阔别采用局限性内切酶EcoR I/Xho I、BamH I/Xho I、BamH I/Xho I双酶切，琼脂糖凝胶电泳结果显示，各重组表达质粒酶切后均出现两条带（图2），此中大片断均与质粒pET-28a单酶切片断长度一律，幼片断阔别与de1、de2、de基因的目标片断长度一律，进一步测序结果证据3 个基因的重组表达质粒均修筑凯旋。

　　将重组质粒转化至BL21（DE3）取得工程菌株BL21（DE3）/pET-de1（DE1），BL21（DE3）/pET-de2（DE2）及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de（DE），对工程菌株举行PCR检测、质粒及酶切验证，序列比对结果显示工程菌修筑凯旋。

　　3 工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达产品的SDS-PAGE了解

　　对工程菌株DE1、DE2、DE去饱和酶基因诱导表达的酶卵白举行SDS-PAGE检测，结果见图3。与 E. coli BL21（DE3）的卵白SDS-PAGE结果举行比拟了解，发掘工程菌株DE1、DE2的重组酶正在分子质料约40、32 kDa控造的条带阔别较 E.coli BL21（DE3）清楚加深，与表面分子质料较靠拢（DE1的为39.8 kDa，DE2的为31.8 kDa）。结果证实，去饱和酶基因 de1 、 de2 正在 E.coli BL21（DE3）中竣工了高效单表达和共表达。

　　对工程菌株DE1、DE2、DE教育6 0 h内的OD 600nm 举行监测，其孕育弧线 h控造达孕育峰值，其后孕育趋于安闲。从教育经过的孕育弧线 株菌株显露与野生菌株相同的孕育弧线，解释表源的去饱和酶基因 de1 、 de2 单表达和共表达经过中，工程菌株仍能保护有用的孕育。然而，24～60 h，工程菌株的孕育均略低于野生菌株，大概因为表源基因表达经过中，插入新的酶会酿成合成代谢滋扰内源性代谢，合成代谢和内源性代谢之间的竞赛导致代谢承当，从而导致宿主的应激反映和心理蜕变，惹起工程菌株孕育量的消浸。

　　红四氮唑行动一种氧化剂，能够从去饱和酶继承电子，后自己从无色被还原为赤色的甲攒，从而能够表征细胞内去饱和酶活性。工程菌株和野生菌株60 h内的酶活性蜕变弧线、DE的去饱和酶活性正在60 h诱导经过中均高于野生菌株，尤以24 h的酶活性最高，阔别为同工夫野生菌株的1.38、1.48 倍和1.75 倍，证实去饱和酶基因 de1 、 de2 正在24 h内即竣工了高秤谌的表达；24 h后工程菌株酶活性呈低浸趋向，大概是因为表源基因的过表达导致 E.co li 中造成洪量的见谅体。而发酵后期跟着养分物质损耗以及细菌孕育进入阑珊期 ，去饱和酶活性趋于稳固，但仍略高于或与野生菌株的酶活性靠拢。

　　6 去饱和酶基因de1、de2单表达和共表达对油脂产量及脂肪酸组分的影响

　　为最大水准消除大概因为见谅体的造成导致局限菌株去饱和酶活性低浸，而酿成后续尝试对细菌脂肪酸产量及脂肪酸构成因素的尝试误差，本咨议仅采集了工程菌株和野生菌株发酵24 h的菌体样品举行细菌油脂的提取及其脂肪酸组分了解。

　　如图6所示，去饱和酶基因的表达有用加强了细菌脂质的积攒，与野生菌株比拟，工程菌株的油脂产量和质料分数均明显提升。DE1、DE2、DE的油脂产量阔别可达0.57、0.58、0.72 g/L，均较野生菌株提升83%以上，而油脂质料分数从野生菌的9.45%提升至18.44%以上，阔别较野生菌株提升97.78%、95.17%、135.09%。总的来看，去饱和酶基因 de1 与 de 2 共表达对油脂产量和含量提升的鞭策感化明显优于这两个基因单表达的，这与Yan Fengxin等正在解脂耶氏酵母表达Δ12和Δ15去饱和酶基因鞭策脂质积攒结果更明显的结论一律。

　　将提取的细菌油脂举行甲酯化后，行使气相色谱对脂肪酸组分举行定性和定量了解。基于37 种脂肪酸甲酯混标对油脂样品举行折柳定性，对比尺度品参考图谱得出各组分的出峰功夫，采用十五烷酸甲酯行动内标对脂肪酸甲酯举行定量了解。菌株脂肪酸组分及其质料分数见表3。

　　表3显示，E.coli BL21（DE3）的油脂脂肪酸组分以棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）为主，其次为豆蔻酸（C14:0）、亚油酸（C18:2）。3 株工程菌中油脂脂肪酸仍以上述4 个组分为主，但各组分的质料分数却产生了清楚的蜕变。此中，C8:0、C15:1、C18:0脂肪酸质料分数均高于野生菌株，越发是工程菌株DE1、DE中的不饱和脂肪酸组分C15:1、C18:2、C22:2质料分数均明显高于野生菌株。为揭示去饱和酶基因de1、de2单表达及共表达对油脂脂肪酸组分的影响，统计了工程菌株DE1、DE2、DE相看待野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸的提升量食品。如图7所示，工程菌株中饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸含量均提升，饱和脂肪酸含量阔别提升72.26%、66.93%、123.21%，不饱和脂肪酸含量阔别提升112.18%、44.18%、134.30%，证实去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的改进。

　　表面上，去饱和酶特异性地鞭策成熟脂肪酸中顺式双键的造成，将饱和状况下的脂肪酸去饱和，环节布局域和环节位点组成去饱和酶的活性核心并影响其活性，且差异的催化底物对催化速度也出现必定的影响。有咨议证实，脂肪酸去饱和酶的类型、表达秤谌和活性定夺了不饱和脂肪酸的定性和定量构成，出格去饱和酶的过表达能够鞭策细胞内单不饱和脂肪酸的富集和脂质积攒，从而到达改进脂肪酸组分的结果。本咨议通过对工程菌株相看待野生菌株中饱和与不饱和脂肪酸含量的提升量举行统计了解，注通晓去饱和酶基因的表达有利于E.coli中脂肪酸组分的改进，越发是不饱和脂肪酸含量的提升。表4总结了近年来酵母菌和E.coli中过表达去饱和酶基因惹起菌株不饱和脂肪酸组分和含量蜕变的咨议结果，可见去饱和酶看待脂肪酸组分的改进至闭主要食品，过表达差异泉源的去饱和酶基因看待高产油工程菌或出格组分工程菌的修筑拥有主要使用价格和表面意旨。

　　正在E.coli BL21（DE3）中表达了来自产油核桃内生菌B.subtilis HB1310的去饱和酶基因，修筑了单基因表达菌株BL21（DE3）/pET-de1食品、BL21（DE3）/pET-de2及共表达菌株BL21（DE3）/pET-de，竣工了去饱和酶基因的高表达，有用鞭策了E.coli去饱和酶活性的提升，使脂肪酸积攒量得以添加，提升了菌株油脂产量和含量，改进了脂肪酸组分，越发使不饱和脂肪酸含量明显提升。本咨议可为产油脂工程菌的开拓和使用供应有价格的菌种泉源，对高效产油工程菌的修筑拥有必定的使用价格。

　　本文《过表达去饱和酶基因对大肠杆菌脂肪酸合成的影响》泉源于《食物科学》2023年45卷第2期72-78页，作家：叶 景，许思远，张 琴，钱 程，曹娟娟，赵 沛。DOI:10.7506/spkx0509-076食品。点击下方 阅读原文即可查看著作闭连讯息。

　　练习编纂：天津贸易大学生物技艺与食物科学学院 梁雯菁；负担编纂：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片泉源于著作原文及摄图网。

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